소나무속 6수종 묘목의 소나무재선충병에 대한 포지 저항성 비교

본 연구에 사용된 소나무속 6종은 곰솔, 잣나무, 소나무, 섬잣나무, 리기테다소나무, 스트로브잣나무로 5~8년생 묘목들이며 같은 종의 묘목들은 연령이 동일했다(Table 1). 묘목들은 종마다 다른 곳에서 양묘되다가 2021년 3월 30일과 4월 2일에 서울대학교 칠보산 학술림 포지로 이식되었다. 소나무 묘목은 국립품종관리센터의 안면도 채종원 종자를 2016년에 채집하여 칠보산 학술림 온실에서 2017년에 파종한 뒤 2019년에 포지로 이식되었다. 리기테다소나무 묘목은 국립산림과학원 산림생명자원연구부에 있는 리기테다소나무 성목로부터 종자를 받아 국립산림과학원 포지에서 양묘되었다. 나머지 4종은 양묘상으로부터 구입한 것이며, 그중 섬잣나무의 경우 곰솔을 대목으로 한 접목묘였다. 실험에 사용한 묘목들은 하나의 주간이 곧게 뻗어 올라왔으며 건강한 생육상태였다. 묘목들의 수고 및 근원경(Root collar diameter)은 2021년 7월 9일에 측정하였다(Table 1).

본 연구에 사용한 소나무재선충은 국립산림과학원에서 2021년에 분양 받아 계대배양하였다. 소나무재선충의 먹이원인 Botrytis cinereal Pers.를 먼저 배양하였으며 이를 위해 고형 PDA 배지(potato dextrose agar medium)를 만들었다. PDA 배지는 Difco™ Potato Dextrose Agar (BD, USA) 용액(39 g·l⁻¹)을 멸균한 뒤 90 mm Petri dish(현대마이크로, 대한민국)에 약 35 ml씩 부은 다음 15시간 이상 자외선소독을 하면서 굳혔다. 완성된 고형 PDA배지에 B. cinerea를 접종한 다음 배양기에서 25°C, 암조건으로 7일간 배양했다. B. cinerea가 잘 자란 PDA 배지에 소나무재선충을 접종한 다음 배양기에서 25°C, 암조건으로 7일간 배양했다. 이후 소나무재선충은 4°C 냉장고에서 보관했으며 30일이 지나기 전에 새로운 B. cinerea가 자란 PDA 배지에 다시 계대배양하였다.

소나무속 6종에 대한 소나무재선충 접종은 2021년 6월 25일에 시행되었으며 Woo et al.(2018)의 방법을 참고하였다. 각 수종당 묘목 9그루(실험군)에 소나무재선충 1만마리가 들어있는 증류수 100 μl를 접종했으며, 다른 묘목 9그루에는 대조군으로 사용하기 위해 증류수 100 μl를 접종했다. 다만, 곰솔은 실험군이 10그루, 대조군이 8그루였다. 접종방법은 지상 10 cm 높이에서 묘목 수피를 세로로 잘라 틈을 만든 다음, 화장솜을 끼우고 화장솜과 형성층 사이로 액체를 주입했다. 접종 후에는 파라필름을 감싸서 소나무재선충이 밖으로 새지 않고 형성층으로 잘 들어갈 수 있게 하였다. 모든 소나무 묘목들은 접종일부터 2주 간격으로 사진을 촬영했으며 기온이 영하로 내려가 소나무재선충 증식이 더 이상 이뤄지지 않는 24주 후에 실험을 종료했다.

접종 24주 후 묘목에 있는 소나무재선충의 검출을 위해 Baermann funnel 법을 사용하였다(Baermann, 1917). 우선 묘목의 주간과 가지를 잘게 잘라(<5 mm) 24시간 후에 밑에 모인 용액을 20 ml 추출하였다. 그리고 슬라이드 글라스에 10 μl씩 옮겨서 실체현미경(Olympus SZ61, Tokyo, Japan)을 통해 10~20배율로 관찰하였다. 묘목 당 총 5번 관찰하여 소나무재선충의 검출여부를 확인하고, 검출이 된 경우 소나무재선충의 수를 측정했다. 그리고 Baermann funnel 법에 사용한 주간과 가지를 80°C에 7일간 건조한 뒤 건중량을 측정하여 소나무재선충의 밀도를 계산했다.

소나무재선충 접종 후 10주 이내에 고사한 묘목들은 즉시 Baermann funnel 법으로 소나무재선충 검출 여부를 판별하였다. 검출되지 않은 경우 소나무재선충 이외의 요인(이식 스트레스 등)에 의해 고사한 것으로 판단하고 실험 대상에서 제외하였다. 정상적으로 실험이 이뤄진 묘목들 중에서, 접종 24주 후 묘목의 고사 여부를 판단하여 고사율을 측정했다. 또한 소나무재선충을 접종한 묘목들은 Baermann funnel 법을 통해 소나무재선충 검출율 및 밀도를 측정했다. 그리고 증류수를 접종한 대조군에서도 종별로 1개 묘목에서 소나무재선충 검출 여부를 확인하였다.

소나무재선충에 의한 피해 정도는 사진을 이용해 위조지수로 수량화 하였다(Figure 1). 위조지수는 모든 잎이 푸르고 증상이 없는 상태가 0, 25% 미만의 잎이 마르거나 갈변했을 때가 1, 25~50%의 잎이 마르고 갈변한 경우는 2, 50~75%의 잎이 마르거나 갈변한 경우는 3, 마지막으로 75% 이상의 잎이 마르고 갈변하거나 나무가 완전히 고사한 경우는 4로 등급화했다(Yu et al., 2012; He et al., 2016; Modesto et al., 2022a; Modesto et al., 2022b).

Figure 1. Wilting process of a Pinus densiflora seedling inoculated by pine wood nematode. Wilt index^a of (A), (B), (C), (D) and (E) are 0, 1, 2, 3 and 4, respectively. ^a 0 : absence of wilt or brown leaves, 1 : <25% of wilt or brown leaves, 2 : 25~50% of wilt or brown leaves, 3 : 50~75% of wilt or brown leaves, 4 : 75≤ wilt or brown leaves or death of the seedling.

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인공접종 24주 후의 소나무재선충 밀도, 검출율, 고사율 및 위조지수의 수종간 차이를 확인하기 위해 비모수 일원분산분석(One-way ANOVA)인 Kruskal–Wallis 검정과 Bonferroni correction 사후검정을 실시하였다. 통계분석은 R software v. 4.2.2 (R Core Team, 2022)으로 수행하였다.

소나무재선충을 접종한 묘목들의 접종 24주 후 소나무재선충 검출률은 Table 2와 같으며, 고사율과 함께 막대그래프로 시각화 하였다(Figure 2). 소나무재선충을 접종한 묘목들 중, 조기에 고사한 소나무 1그루(8주차)와 스트로브잣나무 1그루(6주차)는 소나무재선충이 검출되지 않았으며, 이식 스트레스로 인한 고사로 판단하여 통계에서 제외하였다. 소나무재선충의 검출율은 수종 간에 통계적으로 유의한 차이를 보였다. 곰솔(80.0%)과 잣나무(77.8%)가 스트로브잣나무(0%) 보다 소나무재선충 검출율이 유의하게 높았으며, 중간 수치를 보여준 소나무(62.5%), 섬잣나무(22.2%), 리기테다소나무(22.2%)는 다른 수종과 유의한 차이를 나타내지 않았다. 증류수를 접종한 묘목에서 수종별로 1그루씩 선정하여 소나무재선충을 검출해본 결과 6그루 모두 검출되지 않았다.

Figure 2. Death percent by pine wilt disease and detection percent of pine wood nematodes of six pine species in 24 weeks post-inoculation with pine wood nematode.

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소나무재선충으로 인한 고사율의 경우 리기테다소나무를 제외하면 모두 고사율과 동일하였으며, 고사한 묘목들은 소나무재선충이 검출된 묘목들과 일치했다. 리기테다소나무는 소나무재선충이 검출된 묘목 2그루 모두 생존하여 고사율이 0%였다. 통계 분석 결과 고사율도 수종에 따라 유의한 차이를 보였는데, 곰솔(80.0%)과 잣나무(77.8%)가 리기테다소나무(0%)와 스트로브잣나무(0%) 보다 유의하게 높았다. 중간 수치를 기록한 소나무(62.5%), 섬잣나무(22.2%)는 다른 수종과 유의한 차이를 나타내지 않았다. 증류수를 접종한 대조군의 경우 섬잣나무 1그루(10주차), 잣나무 2그루(6주차), 스트로브잣나무 1그루(4주차)를 제외하고는 모두 생존하였다. 조기에 고사한 묘목 4그루 모두 소나무재선충이 검출되지 않았으며, 이식에 따른 스트레스로 인하여 고사한 것으로 판단된다.

곰솔, 잣나무는 통계적으로 유의미하게 높은 소나무재선충병 감수성을 보인다고 할 수 있으며 이는 기존 연구결과와 동일하다(Mamiya, 1983). 소나무는 62.5%의 고사율로 곰솔과 잣나무보다 낮았으며, 곰솔이 소나무보다 감수성이 높다는 연구결과(Woo et al., 2020)와도 부합하지만, 통계적으로 다른 수종과 유의한 차이를 보이지는 못했다

섬잣나무는 검출률과 고사율이 22.2%로 상당히 낮은 수치를 보여주었지만 통계적으로 다른 수종과 유의한 차이를 보이지 못했다. 섬잣나무는 한국에서는 울릉도에서만 자생하고 조경용으로 일부 식재되어 감염보고가 드물었으나, 본 연구에서처럼 소나무재선충병으로 인하여 고사한다는 연구결과가 일부 있었기 때문에 섬잣나무에 대한 소나무재선충 방제에도 주의를 기울여야 할 것이다(Takeuchi, 2008; Koh et al., 2016).

리기테다소나무와 스트로브잣나무는 고사율이 0%로서 기존 연구결과처럼 강한 저항성을 보였다고 해석된다(Mamiya, 1983). 리기테다소나무의 소나무재선충 검출률은 22.2%였지만, 24주 후까지 고사는 없었으며 잘 생육하였으므로 소나무재선충병에 걸리지 않았다고 볼 수 있다. 종합해보면 곰솔, 잣나무는 강한 감수성을, 소나무와 섬잣나무는 중간 수준의 감수성을, 리기테다소나무와 스트로브잣나무는 저항성을 보여주었다.

접종 24주 후 묘목에서 추출된 소나무재선충의 평균 밀도는 Table 2에 명시했으며, Figure 3에 상자 수염 그림(Box-and-Whisker Plot)으로 나타냈다. 소나무재선충 평균 밀도는 6종 중에서 잣나무가 153.65 마리·g⁻¹으로 가장 높았다. 그리고 내림차순으로 곰솔(105.05 마리·g⁻¹),섬잣나무(83.39 마리·g⁻¹), 소나무(36.04 마리·g⁻¹) 순이였다. 리기테다소나무(0.27 마리·g⁻¹)는 소나무재선충이 극소량이 발견되었고, 스트로브잣나무는 모든 묘목에서 검출되지 않았다. 통계 분석 결과 곰솔과 잣나무가 스트로브잣나무보다 유의하게 높았으며, 다른 수종은 유의한 차이를 보이지 않았다.

Figure 3. Pine wood nematode density of six pine species in 24 weeks post-inoculation with pine wood nematode. ^a,b Grouping by Bonferroni correction test at α = 0.05.

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소나무재선충 밀도는 소나무재선충의 검출률 및 고사율과 크게는 유사한 경향을 보였지만, 자세히 들여다보면 어느 정도 차이를 보였다. 우선 검출률과 고사율 분석에서 감수성을 나타내는 곰솔, 잣나무, 소나무, 섬잣나무의 소나무재선충 평균 밀도가 모두 30 마리·g⁻¹ 이상이었으며 이들 수종에서 소나무재선충이 활발히 번식했음을 보여준다. 반면 검출률과 고사율 분석에서 저항성을 보여준 리기테다소나무는 평균 0.27 마리·g⁻¹에 그쳤으며 스트로브잣나무는 모두 검출되지 않았다. 스트로브잣나무의 경우 접종 후에 소나무재선충이 번식에 실패한 것으로 보이며, 리기테다소나무의 경우 소나무재선충이 번식은 했지만, 병을 일으킬 만큼 증식하는 데는 실패하고 소수 만이 생존에 성공한 것으로 보이며 선행연구에서도 비슷한 결과가 나타난 바 있다(Woo et al., 2018).

감수성을 나타내는 수종의 경우, 곰솔 보다 약간 낮은 고사율을 보인 잣나무에서 오히려 1.5배 정도 높은 소나무재선충 평균 밀도가 나타났고, 다른 3개 수종보다 확연히 낮은 고사율을 보여준 섬잣나무의 소나무재선충 평균 밀도는 소나무보다 2배 이상 높았다. 소나무재선충의 평균밀도는 검사하는 부위나 시기에 따라 달라질 수 있으며, 일정 수 이상보다 높아지면 소나무재선충병이 발병한다고 볼 수 있기 때문에 본 연구의 밀도 분석을 자세히 하기에는 한계가 있었다.

소나무재선충 접종에 사용한 묘목들의 위조지수는 처음에는 모두 0이였으며, 접종 후 4주까지 그대로 유지되었다[Figure 4(A)]. 곰솔, 소나무, 스트로브잣나무, 섬잣나무의 위조지수가 6주차부터 증가하기 시작했으며, 잣나무는 8주차, 리기테다소나무는 10주차부터 증가하였다. 곰솔과 소나무는 12주차에 평균 위조지수가 2를 넘었고, 잣나무는 14주차에 2에 도달했다. 곰솔은 12주차부터 계속 1위를 기록했으며, 16주차에 평균 위조지수가 3을 돌파했다. 잣나무는 16주차부터 소나무보다 평균 위조지수가 커지기 시작했고, 18주차에 3을 돌파했다. 소나무는 평균 위조지수가 2.9로 3을 돌파하지는 못했으며, 섬잣나무는 18주차부터 1.7을 유지했다. 리기테다소나무와 스트로브잣나무는 1 이하를 유지했다. 이후 20주차부터 24주차까지 모든 수종에서 위조지수가 그대로 유지되었다. 24주차에서 가장 높은 위조지수를 보인 것은 곰솔(3.5)이였으며, 잣나무(3.2), 소나무(2.9), 섬잣나무(1.7), 스트로브잣나무(1.0), 리기테다소나무(0.9) 순으로 감소하였다(Table 2). 통계 분석 결과 곰솔은 리기테다소나무와 스트보르잣나무 보다 유의하게 높은 수치를 보여주었으며 다른 수종에서는 유의한 차이를 보여주지 못했다.

Figure 4. Pine wilt disease symptoms progression expressed in average wilt indexa for every 2 weeks post-inoculation with pine wood nematode (A) and distilled water (B). ^a 0 : absence of wilt or brown leaves, 1 : <25% of wilt or brown leaves, 2 : 25~50% of wilt or brown leaves, 3 : 50~75% of wilt or brown leaves, 4 : 75≤ wilt or brown leaves or death of the seedling.

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증류수를 접종한 대조군 묘목들의 위조지수들은 처음의 0에서 크게 증가하지는 않았지만, 24주차의 값이 1.5~0.8 사이의 값으로 증가하였다[Figure 4(B)]. 이들 묘목들은 일부 잎이 마르거나 변색되었지만 전체적인 생육상태는 양호했으며, 이식으로 인한 스트레스나 겨울 휴지기를 대비해 엽록소가 제거되는 과정이라고 생각된다.

실험군과 대조군의 24주차 평균 위조지수를 비교해보면, 검출률과 고사율이 62.5% 이상이었던 곰솔(0.9)이나 잣나무(1.0), 소나무(1.3)는 실험군과 확연히 차이가 났지만, 22.2% 또는 0%를 보여준 섬잣나무(1.5), 스트로브잣나무(1.1), 리기테가소나무(0.8)의 경우 실험군과 큰 차이를 보이지 않았다. 그러나 강한 감수성을 지닌 수종이라도 소나무재선충병의 병징 발현이 느려져서 위조지수가 증가하지 않거나, 다른 원인으로 인해 잎마름이 발생하여 위조지수가 증가할 수 있기 때문에 위조지수만으로 소나무재선충병을 판단할 수는 없을 것이며 현장에서의 보조적인 지표로 활용할 수 있을 것이다.