낙엽송 클론 채종원에서 구과 채취시기에 따른 구과특성 및 종자품질

일본잎갈나무 클론 채종원은 충청북도 충주시 수안보면 수회리 산40-1(36°52′29′′N, 127°58′30′′E)에 위치해 있으며, 1968년도에 조성되었다. 조성 면적은 7 ha이고 현존 본수는 495본(2017년 기준)이다. 여러 차례의 성숙단계별 구과를 채취하여야 하기 때문에 개화량이 충분하고 안정적인 시료 채취가 가능할 것으로 예측되는 10클론 25본(2021년) 그리고 11클론 26본(2022년)을 선정하였다.

2021년에는 구과가 미성숙한 7월 말부터 자연적인 종자산포가 충분히 진행된 10월 초까지 채취하였다. 2주 간격으로 채취하였으며 구과 성숙이 진행되는 시기라고 여겨지는 8월 둘째 주부터 9월 둘째 주(Barnett, 1976) 사이에는 1주 간격으로 채취하여 총 8회 채취하였다. 2022년에는 채취 시기를 3주 앞당겼고, 전년도 조사로 일본잎갈나무 구과 및 종자 성숙 단계에 큰 변화가 있다고 여겨진 7월 말에서 8월 초에는 1주 간격으로 채취하였다.

구과의 형태적 변화를 관찰하기 위해 채취 시기별로 구과 형태와 내부의 종자가 온전한 구과를 채취하여 구과 크기(무게, 길이, 폭)와 색을 조사하였다. 채취 시기별로 같은 클론에서 5-7개 구과를 채취 직후 사진 촬영하였고 HSV 색 공간 변환 방법을 통해 구과 이미지 파일에서 갈색 면적(Hue 18 이하)을 도출하여 전체 구과 면적(픽셀 수) 대비 갈변한 면적의 비율을 계산했다. 이후에 클론당 1-3개 구과는 함수율 측정기(AND MF-50)를 이용해 구과 함수율을 측정하였다. 다만 구과 채취기간 동안 장마 기간이 겹쳤을 경우에는 이상치로 간주하여 통계 분석에서 제외하였다.

구과의 발달과 피해 정도를 조사하기 위해 각 채취 시기 별로 클론당 3-5개의 구과를 미 농무부(1977)의 가이드라인을 참고하여 분석하였다. 먼저 각 구과의 인편을 분리하여 염성 인편, 비염성 인편의 수를 세고 인편 안쪽의 1차 및 2차 고사배주, 충해종자, 성숙종자의 수를 측정하였다. 성숙 종자는 발아 실험 후 내부의 조직이 온전한 지 직접 확인하는 절단 검사를 거쳐 비립종자, 발아 또는 비발아 종자로 분류하였다.

충해종자를 제외하고 성숙종자만을 대상으로 클론 당 최대 50립, 최소 30립씩 3개 플레이트에 반복하여 발아 검사를 실시하였다. 발아 촉진을 위해 4°C에서 3주 간 수분을 공급하며 저온에서 보관하였고, 빛 8시간, 온도 25°C, 상대습도 70%로 유지되는 생장상으로 옮겨 28일 간 발아종자 수를 확인했다. 발아 조사 기간 동안 발아하지 않은 종자들은 직접 절단하여 배와 배유 조직이 온전한지 확인하고 비립 종자와 충실 종자로 구분했다.

구과분석 및 발아율, 절단 검사 결과 등을 이용하여 채종원의 종자 품질을 진단할 수 있는 지표인 종자생산능력, 고사 배주율, 충해 종자율, 비립종자율, 종자효율, 발아율 그리고 최종 발아 종자의 50%가 발아하는데 까지의 소요일수(T₅₀)를 계산하였다(Table 3).

측정된 구과 및 종자 특성이 채취시기 간 차이가 있는지 검증하기 위한 선형 회귀모델은 식 1과 같다.

Y_ik : i 번째 채취시기에 k 번째 개체로부터 얻어진 관측치

T_i : i 번째 채취시기의 효과

ε_ik : i 번째 채취시기의 k 번째 개체에 대한 관측치의 임의오차(random error) 효과

통계적으로 채취시기 간 차이가 유의미한 경우 Tukey-Kramer HSD로 사후 검정하였고, 아래 공식 2와 같이 채취 시기, 클론, 시기와 클론 간의 상호작용 효과를 검증하였다.

Y_ijk : i 번째 채취시기에 j 번째 클론에서 k 번째 라멧으로부터 구해진 관측치

C_j : j 번째 클론의 상가적 유전효과

TC_ij : i 번째 시기와 j 번째 클론 간의 상호작용 효과

ε_ijk : i 번째 시기에 j 번째 클론의 k 번째 라멧에 대한 관측치의 임의오차(random error) 효과

2021년 조사된 변수들의 공분산 행렬을 이용하여 주성분 분석을 실시하였으며, 2개의 주성분으로 군집화 과정을 거쳤다. 통계분석과 그래프 작성은 Python 3.9.7 version에서 Statsmodels, Pandas, Scipy, Matplotlib, Pillow Library와 SAS JMP 17.1.0를 활용하였다.

채취시기에 따른 구과의 무게, 길이 및 폭은 채취시기에 따른 차이가 나타나지 않았다. 구과의 색은 8월 초부터 대부분의 채종목에서 갈색으로 변하기 시작하였고, 빠른 경우는 7월부터 갈변이 시작된 개체도 있었으며 8월 말부터는 모든 구과가 갈색을 띄었다(Figure 1). 채취 시기 별로 평균을 비교했을 때, 7월 28일부터 8월 4일까지 비교적 짧은 기간 동안 그래프의 기울기가 가장 큰 변화가 나타났다.

Figure 1. Brown area of cones among harvest times in 2022.

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고사 배주율은 조사가 시작된 7월 이후에는 감소 또는 증가하는 경향성이 나타나지 않았다. 비립 종자율과 충해 종자율은 2022년 충해 종자율을 제외하고 채취시기 간 유의미한 차이가 나타났다(p<.001). 2021년(52.52%)에는 2022년 (49.52%)보다 연평균 충해 종자율이 약 3% 높게 나타났으며, 2021년에는 최소-최대값의 차이가 57.05%으로 20.46%인 2022년 보다 높게 나타났다(Table 2). 또한, 조사 시기가 늦어질수록 충해 종자율이 높아졌으며 채취시기 간의 통계적 차이도 유의하였다(p<.001). 그러나 2022년에는 최초 조사일부터 충해 종자율이 42.17%로 높게 조사되었고 시기 간의 차이도 유의하지 않았으며(p>.05) 충해 종자율이 조사 기간 동안 꾸준히 높게 나타났다(Table 2). 종자 효율은 2021년에는 8월 9일(41.15%)부터 8월 16일(13.37%) 사이에 유의미한 감소가 나타났고 이후에는 차이가 없었으며, 2022년에는 7월 28일(13.88%) 이후에 점차 감소했고 8월25일 이후로는 통계적인 차이가 없었다(Figure 2). 또한 2021년에 종자 효율은 충해 종자율과 높은 확률의 부의 상관관계(−0.88)가 나타났으며 비립 종자율과 양의 상관관계(0.41)를 보였다(Table 3).

Figure 2. Seed efficiency among harvest times in 2021 (above) and 2022 (below).

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7월 중순 이전에는 구과 함수율의 변화가 없었으며, 2021년에는 8월 9일(44.81%)부터 16일(20.89%), 2022년에는 7월 28일(51.35%)부터 8월 4일(38.12%) 사이에 유의미한 감소를 보였다(Figure 3). 구과 함수율의 변화는 구과의 색깔 변화보다 늦게 시작되었고 함수율과 갈변 모두 8월 초에 급격한 변화가 나타났다.

Figure 3. Moisture contents among harvest times in 2021 (above) and 2022 (below). Dotted boxes are outliers due to rain 1 day ago.

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발아율은 2021년 채취시기 간에 유의미한 차이를 보였으며(p<.001), 첫번째 채취시기인 7월 26일(17.11%)에서 8월 9일(29.5%) 사이에 크게 증가했고 9월 8일(20.3%)까지는 점차 감소하다가 9월 22일(31.08%)에 가장 높았다(Figure 4). T₅₀은 7월 26일(15.49일)에서 8월 9일(12.01일) 사이에 유의미하게 감소하였고(p<.001) 8월 29일(11.33) 이후로는 시기가 늦어질수록 발아 속도가 빨라져 9월 8일 이후에는 10일 이하로 나타났다(Figure 4). 또한 T₅₀과 함수율, 종자효율의 상관관계는 유의한 양의 계수(0.35, 0.44)가 나타났으며 발아율, 충해 종자율은 부의 상관(−0.43, −0.36)이 있었다(Table 3). 2022년의 발아율은 채취시기 간에 통계적인 차이가 있었으나(p<.001) 값이 매우 낮아(평균 1%) 발아율에 영향을 준 다른 요인이 있었을 것으로 사료되었다. 이에 2022년도 발아율 검정 결과 자료는 채취시기 영향을 보기 어렵다고 판단하여 이후 분석에서 제외하였다.

Figure 4. Germination rate and T₅₀ among harvest times in 2021.

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함수율, 종자 효율, 발아세에 대해 채취시기 효과, 유전적 효과, 상호작용 효과를 검증하고자 이원분산분석을 실시하였다(Table 4). 세 지표 모두 일원분산분석과 마찬가지로 채취시기에 대해 유의미한 효과가 있었다(p<.001). 종자 효율과 발아세는 유전적인 차이가 있었으나(p<.001), 함수율에서는 나타나지 않았다. 채취시기와 유전적 효과 간의 상호작용 효과는 발아세에서 유의하게 나타났고(p=.004), 종자효율은 2021년도에서만 5% 유의수준(p=.013)에서 차이를 나타냈으며, 함수율은 2022년에만 유의미한 차이(p<.001)를 나타났다.

종자 생산 및 품질과 관련된 10개의 변수를 2021년 데이터로 주성분 분석을 수행한 결과, 제1주성분과 제2주성분의 누적기여도는 57.45%이었다. 제1주성분은 구과의 형태적 특성과 관련한 변수들인 구과 길이, 구과 폭, 구과 무게, 염성인편 수, 고사배주 수, 비립종자 수, 충실종자 수의 기여도가 높았고, 제2주성분은 채취시기에 따른 종자품질 변화와 관련된 변수들인 충해종자 수, 비립종자 수, 충실종자 수, 발아세에 대한 기여도가 높았다(Table 5). 4번째 채취시기(8월 22일) 이후로 대부분의 클론에서 제2주성분이 양수로 나타났으며, 군집도에서 가장 크게 분기된 두 그룹은 각각 7월 26일~8월 16일과 8월 22일~10월 5일에 채취된 클론들이다(Figure 5).

Figure 5. (A) PCA of 10 variables related to cone and seed quality, (B) Hierarchical clustering for 2 principal components. The colors represent the harvest times in 2021.

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본 연구는 일본잎갈나무 종자 생산을 위한 채취적기를 구명하기 위해 두 해에 걸쳐 시기별로 구과를 채취하여 구과 특성과 종자 품질을 분석하였으며, 이에 따른 종자의 채취 적기는 크게 종자 품질과 생산량이라는 두 가지 측면에서 논의될 수 있다. 첫째, 종자 품질 측면에 있어서는, 종자의 발아율이 유의하게 높아진 시기는 조사 결과 8월 초였으며, 발아속도 또한 8월 초부터 빨라지기 시작하였고 구과 채취가 늦어질수록 발아속도가 빠른 종자를 얻을 수 있었다. 그러나 종자의 성숙은 연기후에 영향을 받으므로(Buechling et al., 2016; Henttonen et al., 1986), 연중 채취일을 특정하는 것보다 채취 적기를 판단하는 지표를 마련하는 것이 중요하다. 이와 관련된 구과 특성을 살펴보면, 8월 초에는 구과의 갈변이 급격히 증가하면서 구과 함수율 역시 감소하기 시작하였으며, 이 시기는 종자의 발아능이 높아진 시기와도 일치한다. 또한 모든 구과가 갈변한 8월 말에는 구과 함수율 역시 유의미하게 감소하였는데, 건조저항성이 있는 진정종자(orthodox seed)의 경우 열매나 구과가 성숙한 후 건조함에 따라 건조저항성을 획득하고 이후 종자세가 증가한다(Bewley et al., 2013; Society for Ecological Restoration, International Network for Seed Based Restoration and Royal Botanic Gardens Kew, 2023). 따라서 진정종자인 일본잎갈나무 종자의 경우에도 구과의 색이 변하고 함수율이 감소하기 시작하는 시기에 발아능을 먼저 획득하고, 구과 함수율 감소와 종자 성숙이 계속되면서 종자세가 증가한 것으로 볼 수 있다. 이와 같이 구과의 갈변 정도와 함수율은 종자 품질과 큰 상관이 있었으며 현장에서 채종목 집단의 종자 채취 적기를 판단하는 간편한 지표로 활용할 수 있을 것으로 보인다.

종자 생산량 측면에서의 채취 적기는 병해충 피해, 종자 비산 등에 의한 손실을 최소화하여 충실 종자 생산량을 최대로 하는 시기여야 한다. 이를 위해 미국 농무성에서 채종원의 종자 생산을 진단하기 위해 개발된 구과 분석 방법과 지표들을 활용하였다(Bramlet et al., 1977). 그 결과, 구과의 전체 종자생산능력 대비 충실 종자 비율을 나타내는 지표인 종자 효율이 2021년에는 8월 16일, 2022년에는 7월 21일 이후에 점차 감소한 것을 확인할 수 있었다. 이 같은 경향은 충해 종자율이 채취 시기가 늦어짐에 따라 증가하는 추세를 보였으므로 주로 해충 피해에 기인한 것으로 보인다.

이와 같은 결과를 종합할 때, 충실 종자 생산량을 최대로 하면서 발아율이 높은 종자를 얻기 위한 채취 적기는 8월 초로 나타났으며, 이는 구과의 갈변 면적이 크게 증가하고 구과 함수율이 크게 감소하는 시기와 일치한다. 이후에는 종자 성숙이 진행되어 종자세가 증가하나 병해충 피해와 종자 비산에 따른 손실이 있으므로, 종자 품질을 우선시한다면 해충 발생 시기에 적절한 방제를 시행하고 채취 시기를 늦추는 전략도 가능할 것이다. 구과의 성숙 시기는 연간 기후나 채종원 관리에 따라 달라질 수 있으므로 육안으로 확인하여 대부분의 구과에서 갈변이 약 70% 진행되었을 때를 적정 채취시기로 결정하는 것을 제안한다.

본 연구는 2021년과 2022년, 두 해에 걸쳐 동일한 품질 지표를 대상으로 수행되었으나, 각 지표들의 경향성이 다르게 나타났다. 2022년의 경우, 발아율이 평균 1%로 매우 저조하였고, 고사 배주와 비립 종자 비율도 2022년에 각 8%, 10% 만큼 더 높았다(Table 2). 이는 화분 부족이나 수정, 발달 시기의 병해충 피해 또는 매우 낮은 암구화수 생산량(개체목당 평균 4개)과 생식능력 저하가 원인일 수 있다. 특히 일본잎갈나무는 침엽수 중에서도 종자 생산의 풍흉 주기(masting period)가 길고 차이가 큰 것으로 알려져 있다. 침엽수의 풍흉 주기는 꾸준한 종자 생산에 제한 요소가 되며(Creain and Cregg, 2018, Sala et al, 2012), 2022년에는 극심한 흉년으로 해당 일본잎갈나무 채종원의 생식능력이 저하된 것으로 보였다.

충해종자 비율은 채취시기가 늦어질수록 증가하는 경향이 있었던 2021년과 다르게 2022년에는 7월 초부터 40% 이상으로 높게 나타났다(Table 4). 이는 2022년에 매우 저조했던 암구화수 생산으로 인해 암배우체나 접합자 단계부터 충해를 많이 받았던 것으로 보였다. 충해 종자 비율은 종자 생산량에 직접적으로 영향을 주는 지표이므로 암구화수 생산량이 적은 해에는 종자효율을 최대화하기 위해 특히 해충 방제가 중요하다.

주성분 분석과 군집분석을 통해 채취시기별로 구과와 종자 특성을 그룹화하였다. 군집화에서 크게 두 그룹으로 나뉘었고 한 그룹은 대부분 채취시기 7월26일~8월16일에, 다른 그룹은 8월22일~10월5일에 속했다(Figure 5). 이에 따라 본 일본잎갈나무 채종원의 구과와 종자 특성이 크게 변화한 시기는 8월 초에서 중순으로 나타났다. 이 시기는 구과의 갈변과 함수율에 큰 변화가 있었던 시기와 동일하다(Figures 1, 3). 대부분의 지표들은 클론에 따라 차이가 나타났던 반면 함수율은 통계적으로 유의한 유전적 차이가 나타나지 않는 지표였다(Table 4). 따라서 함수율과 구과의 갈변 정도는 채종원 관리자가 채종목의 구과 성숙 상태를 파악할 수 있는 적절한 지표가 될 수 있다.

종자 품질에는 종자 수명과 저장 동안의 성숙 정도도 영향을 미칠 수 있다(Bonner, 1987; Pieta and Ellis, 1991). 본 연구에서는 채취 후 바로 파종하였을 때의 종자 발아율과 발아 속도만을 확인하였으므로 주요 조림 수종의 장기간 종자 보관을 위해서는 채취시기별 종자 저장 및 품질 유지와 해당 종자로부터 생산된 묘목의 품질 평가에 대한 연구가 추후 수행되어야 한다.