기계톱 작업에 사용되는 윤활유가 송이(Tricholoma matsutake (S. Ito & S. Imai) Singer) 균사 생장에 미치는 영향

숲 가꾸기 현장에서는 기계톱의 윤활유로 체인오일 대신 차량의 엔진오일을 이용하는 경우도 있으며, 기계톱의 연료에 엔진오일을 섞는 경우가 있어 체인오일과 엔진오일을 실험에 사용하였다. 본 실험에서는 구성성분에 따라 광유계 체인오일(Mineral Chain oil, Husqvarna, Sweden), 생분해성 체인오일(X-GUARD Bio Chain Oil, Husqvarna, Sweden) 그리고 합성유계 엔진오일(Kixx D1 Turbo, GS Caltex, South Korea) 등 총 3개 종류에 대하여 균의 성장 저해 여부를 평가하였다. 송이 균사에 처리할 체인오일과 엔진오일의 양을 결정하기 위해 숲 가꾸기 작업 시뮬레이션을 수행하였다.

실제로 숲 가꾸기 작업 동안 지표면에 표착되는 양을 추정하기 위해서 전문가와의 인터뷰를 통해 적정량을 추정하였다. 국립산림과학원 산림기술경영연구소 담당 연구관의 자문에 따르면 평균적인 솎아베기 과정은 1ha 당 128시간이 소요되며, 이 때 기계톱 운영시간은 전체 작업시간의 50~60%였다. 따라서 솎아베기를 할 때 1ha 당 약 64~77시간을 기계톱 운용시간으로 보고 이를 바탕으로 숲 가꾸기 작업을 1ha 할 때, 전기톱 실제 가동시간 60% 조건에서 1일 기준 근로(8시간) 동안 2명의 작업자가 수행하는 것으로 하였다.

숲 가꾸기 시뮬레이션은 총 3개의 거름종이 클러스터를 동시에 설치하고 그 위에서 5분간 전기톱을 작동시켜 비산, 점적되는 오일의 양을 확인하였다[Figure 1(A)]. 이러한 과정을 3번 반복하여 총 9개의 클러스터에 대한 데이터를 수집하였다. 하나의 클러스터를 기준으로 그 위에서 전기톱을 작동시키는 작업은 전기톱을 이용하여 벌목 또는 가지치기를 하는 과정에 해당되며, 다른 클러스터 위에서 전기톱을 작동시키는 작업은 전기톱을 들고 다른 임목을 향해 이동하는 과정으로 설정하였다.

Figure 1. Oil emission experiment during chainsaw operation simulation; (A) array of 33 filter papers used to collect scattered oil droplets, (B) close-up of filter paper after the experiment showing oil spots.

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송이 균사가 존재하는 토양 내부에 침투되는 오일의 양을 계산하기 위해 기름유출 사고가 났을 때의 조간대 모형을 설계하여 오일의 토양 침투량을 측정한 연구를 참고하였다(Cheong, 2005). 연구 결과 8L의 원유가 1m²에 표착되었을 때 지하 4~6cm의 토양 1kg에 침투된 원유의 양은 29.8g이었다. 따라서 해당 연구에서는 지표면 1m²에 8ℓ의 오일이 표착되었을 때, 오일이 토양 질량의 3%를 차지한다고 제시하였다.

시뮬레이션 후, 오일이 방출된 모양에 따라 작은 점으로 흩뿌려진 경우는 비산의 형태로, 덩어리진 방울로 떨어진 경우는 점적으로 보았다[Figure 1(B)]. 각 클러스터별로 1개 거름종이에서 비산, 점적되는 오일양의 평균값을 구한 후 간벌 시 1m²당 지표면에 표착되는 오일의 질량을 계산하였다. 추가적으로 지표면의 오일이 지하로 침투되는 양을 계산하여 각 체인오일들과 엔진오일의 밀도를 이용해 배지에 첨가할 오일의 부피를 정하였다.

시뮬레이션을 통해 설정된 각 오일의 양을 기준으로 송이균 성장 저해 여부를 확인하기 위해 오일 종류별 3단계의 농도 조건을 설정하여 총 9개 실험구와 오일을 첨가하지 않은 대조구 1개를 대상으로 실험을 수행하였다. 송이 균주는 국내 산림에서 자생한 자실체로부터 순수 분리된 것으로 국립산림과학원으로부터 분양 받아 실험에 사용하였다. 송이 균주를 배양하기 위하여 Tricholoma matsutake media(TMM) 고체배지(1L 기준 20g glucose, 20g agar, 1.5g yeast extract, 1.5g soytone) (Kim et al., 2005)를 사용하였으며, 오일의 종류에 따라 농도별로 배지에 첨가하였다.

윤활유의 농도가 미량이기 때문에 TMM 액체배지(1L 기준 20g glucose, 1.5g yeast extract, 1.5g soytone)에 오일을 첨가한 후 serial dilution을 사용하여 농도별로 배지를 제조하였다. 오일이 첨가된 9개의 TMM 액체배지 20㎖를 TMM 고체배지 180㎖에 첨가하여 실험용 배지를 만들었다. TMM 고체배지는 0.1N의 NaOH와 0.1N의 HCl을 사용하여 pH를 5.2로 맞춘 후 고온 조건에서 오일의 변성이 실험에 영향을 미치지 않기 때문에(Minami, 2017) 121°C에서 15분 고압멸균하여 페트리 접시(90×15mm)에 15~20㎖씩 분주하였다.

분양 받은 송이 균주의 가장자리를 7mm 코르크 천공기로 잘라낸 뒤 메스로 잘린 부위를 TMM 고체배지로 옮겨 배양하였다. 접종원이 상치된 고체배지는 배양기에서 25°C 조건으로 암배양하였다. 배양일을 기준으로 30일 간격으로 송이 균사의 생장량을 확인하였다. 확인 방법으로는 송이 균사체의 8방위에서 mm 단위로 측정한 뒤 평균을 계산하였다. 통계분석을 위해 IBM SPSS Statistics 26을 이용하였으며, 각 측정일별로 대조구와 9개 처리구의 생장량에 대해 ANOVA와 Duncan 사후분석을 실시하였다.

숲 가꾸기 시뮬레이션 후 클러스터별로 비산과 점적을 분류하여 계산한 오일양의 평균과 표준오차는 Table 1 및 Table 2에 나타낸 바와 같다. 비산된 오일양의 평균은 시뮬레이션 5분 동안 1개의 거름종이에 0.0277~0.0342g이었으며(Table 1), 점적된 오일양의 평균은 시뮬레이션 5분 동안 1개의 거름종이에 0.0806~0.1227g이었다(Table 2). 시뮬레이션 결과를 바탕으로 향후 배지에 처리할 체인오일, 엔진오일의 양을 계산하기 위해 평균값을 포괄할 수 있는 오일의 비산 및 점적량으로 0.02, 0.06 및 0.12g을 선정하였다.

2020년 우리나라의 평균 임목축적은 165.2m³/ha이며, 숲 가꾸기 작업에 적용하기 위해 평균 임목축적의 1/4인 41.3m³/ha를 베어낸다고 가정하였다. 송이산이 천연림일 경우 작업에 어려움이 있어 속도가 느려지는 것을 반영하여 Mun et al.(2014)이 보고한 벌도 및 조재작업 시간을 1일 작업가능한 면적의 절반, 즉 소나무림은 33.48m³,낙엽송림은 21.93m³으로 하여 ha 당 필요한 작업시간을 고려하였다. 이 때, 1일 근로시간을 6시간 작업 가능한 것으로 하였다(Mun et al., 2014).

앞서 제시한 기준에 따르면 1ha를 작업 시 1일 동안 2명 의 작업자가 필요하며 실제 가동시간 60%(4.8hr/day)을 곱하면 ha 당 9.6시간으로 산출되었다. 이 때, 낙엽송림의 데이터를 이용해 계산한 값이 기준값과 더 가까웠기 때문에 이를 오일의 농도 계산에 이용하였다. 1명이 작업할 경우로 가정하여 ha 당 소요시간을 계산하면 1ha = 1×10⁴m²이므로 산출된 m²당 작업시간은 1.13×10⁻³hr이었다. 거름종이 1장의 면적은 약 6.36×10⁻³m²이지만, 계산상의 편의를 위해 환산을 하지 않고 1.13×10⁻³hr/m²를 기준으로 숲 가꾸기 시간을 계산하였다. 1시간을 60분으로 치환하여 계산할 시 지표면에 표착되는 오일의 양은 약 2.71× 10⁻⁴g/m²이었다.

Cheong(2005)의 연구에서는 조간대 모형을 사용하였기 때문에 수분이 적은 산림토양과 비교하였을 때 3%는 과대치로 판단될 수 있다. 하지만, 해당 수치를 그대로 적용함으로써 실제 숲 가꾸기 과정에서 산림토양에 오일이 침투되는 양보다 더 많은 양이 침투될 가능성을 고려하였다. 조간대 모형을 위해 조석변동을 재현으로 토양이 물 속에 들어갔다 나오는 과정이 반복되었으며, Cheong(2005) 연구에 사용된 Upper Zakum 원유의 밀도는 8.55×10⁻¹kg/ℓ이었다. Upper Zakum 원유 8ℓ의 질량은 6,840g으로 지하 4~6cm 토양 1kg에 침투되는 오일의 값은 약 1.19×10⁻⁷%이었다.

토양에 존재하는 오일의 비율은 약 1.19×10⁻⁹%이었으며, 토양 1kg에 존재하는 오일의 양은 약 1.19×10⁻⁶g이었다. 이 때, 토양 가비중을 1.3으로 가정하면 토양 1ℓ에 존재하는 오일의 양은 약 1.55×10⁻⁶g이므로 1.55×10⁻⁶g/ℓ을 기준으로 최종적인 체인오일 및 엔진오일 처리 농도를 설정하였다.

광유계 체인오일, 합성유계 엔진오일 및 생분해성 체인오일의 밀도는 각각 0.860, 0.880 그리고 0.918g/㎖이다. 따라서 토양 1ℓ에 존재하는 오일의 부피는 광유계 체인오일이 약 1.33×10⁻⁶nℓ, 합성유계 엔진오일이 1.36×10⁻⁶nℓ 그리고 생분해성 체인오일이 1.42×10⁻⁶nℓ 이었다. 배지에 오일을 처리하기 위해 토양 1ℓ 당 오일의 부피를 배지 1ℓ 당 오일의 부피로 환산한 값을 Table 3에 제시하였다.

시뮬레이션 종합 결과, 광유계 체인오일은 ℓ당 8.16nℓ(M1), 4.08nℓ(M2) 및 1.36nℓ(M3), 합성유계 엔진오일은 7.98nℓ(S1), 3.99nℓ(S2) 및 1.33nℓ(S3) 그리고 생분해성 체인오일은 8.52nℓ(B1), 4.26nℓ(B2) 및 1.42 nℓ(B3)로 계산되었다.

송이균 배양 후 30일, 60일 및 90일 간격으로 균사의 생장량을 측정하였다(Figure 2). 통계 분석 결과 모든 날짜에서 집단 간 생장량 차이가 존재하는 것으로 나타났다. 광유계 체인오일을 첨가하여 배양한 후 30일과 90일에서 유의확률은 0.01보다 작았으며(p = 0.00), 배양 후 60일의 분석에서 유의확률은 0.05보다 작았다(p = 0.01). Duncan 사후분석 결과, 송이균 배양 후 30일의 경우 M1 조건만 대조구와 통계적인 유의차를 보였는데, 대조구는 9.6mm의 생장량을 보인 반면, M1 조건은 10.3mm의 생장량을 보였다(Figure 2).

Figure 2. Average mycelial growth measured at 30, 60, and 90 days after exposure to different oil treatments: mineral chain oil (M), synthetic engine oil (S), and biochain oil (B). (a, b, c and d are results of Duncan post-hoc analysis).

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생분해성 체인오일의 배양 후 30일 분석 결과에서는 B3 조건이 B1, B2 조건보다 통계적으로 유의하게 낮은 값을 보였으며, B1과 B2 조건 간에 통계적으로 유의한 차이가 없었다(Figure 2). 배양 후 60일과 90일 모두에서 B2 조건이 다른 두 조건에 비해서 통계적으로 유의하게 생장량이 높았다(Figure 2). 즉, 송이균 배양 후 60일의 경우 대조군의 생장량이 18.3mm인 것과 비교하여 B2 조건에서 생장량이 21.7mm로 B2 조건에서의 생장량이 오히려 높은 것을 확인하였다. 송이균 배양 후 90일의 경우 M1 조건과 B2 조건에서 생장량이 각각 28.4, 30.9mm로 25.4mm의 생장량을 보인 대조구와 통계적인 유의차를 보였다. 즉, 대조구와 통계적인 유의차를 보이는 실험구들 모두 대조구보다 더 높은 생장량이 확인되었다(Figure 2).

합성유계 엔진오일의 경우, 배양 후 30일에 S2 조건의 생장량이 S1, S3조건보다 통계적으로 유의한 수준으로 생장량이 적었으며, 다른 두 조건 사이에는 유의한 차이가 없었다. 합성유계 엔진오일의 배양 후 60일과 90일 생장량 분석 결과, 세 농도 모두 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았다.

대조구와 비교할 때 오일이 처리된 배지에서 생장량 저 하가 일관되게 나타나지 않았다. 이와 관련하여 선행연구들은 다양한 양상을 보였는데, Asemoloye et al.(2020)은 기름 오염이 빈번한 토양에서 Mucor irregularis와 Aspergillus oryzae를 분리한 뒤 엔진오일을 넣은 배지와 엔진오일을 넣지 않은 대조구 배지에 배양시켜 생장량을 비교하였다. M. irregularis는 오일이 10% 포함된 배지에서 생장량이 대조구의 59.96%였으며, 20% 포함된 배지에서 생장량은 대조구의 45.86%였다. A. oryzae는 엔진오일이 10% 포함된 배지에서 생장량이 대조구의 46.69%였으며, 20% 포함된 배지에서 생장량은 대조구의 39.40%로 낮은 생장량을 보였다.

Benguenab와 Chibani(2021)는 UE oil을 인위적으로 오염시킨 토양에서 Aspergillus ustus과 Purpureocillium lilacinum를 분리한 후 원유, 디젤, UE oil이 포함된 배지(각 오일별 2, 4, 6%)에 배양하여 오일이 포함되지 않은 대조구 배지와 생장속도(cm/day)를 비교하였다. A. ustus의 경우 원유 2% 조건에서 대조구에 비해 생장속도가 빨랐으며, P. lilacinum은 원유 6%, 디젤 4%, 6%, UE oil 2%, 6% 조건에서 대조구에 비해 생장속도가 느렸다.

본 연구의 생장량 결과는 Asemoloye et al.(2020)의 Mucor irregularis와 Aspergillus oryzae 생장량 결과 그리고 Benguenab와 Chibani(2021)의 P. lilacinum 생장속도 결과와는 반대의 양상이었다. 즉, 본 연구에서는 대조구와 통계적으로 유의한 차이를 보이는 실험구 모두 대조구보다 생장량이 많았다. 이러한 차이는 숲 가꾸기 과정에서 토양에 비산 및 점적되는 오일의 양이 매우 적은 양이라는 점이 원인일 수 있다. 실제 현장에서 송이균이 자라는 환경에서 토양에 침투되는 오일의 양이 실험 조건보다 더 적고, 토양 내에서 희석될 가능성을 고려하였을 때, 오일이 송이 균사 생장에 미치는 부정적인 영향은 크지 않을 것이다.

또한, 선행연구들은 오일을 분해할 수 있는 진균들을 대상으로 오일을 분해하면서 부정적인 영향을 받아 생장이 저해되었을 가능성이 있다. 송이균의 경우 오일에 대한 직접적 분해가 이루어지지 않기 때문에 저해가 발생하기 어려웠을 수 있다. 따라서, 오일 분해 능력이 없는 송이균과 직접 비교가 어려울 수 있으나 본 연구는 송이균과 윤활유의 상호작용에 대한 초기 연구로서 오일 처리 농도와 종류에 따른 송이 균사 생장에 미치는 영향에 대한 가능성을 제시하고 있다.