목재의 나이테 생성 시기에 따른 DNA 추출 수율 및 PCR 성공률: 소나무(Pinus densiflora) 목재의 사례

서 론

불법 목재는 무분별한 벌채로 인해 생태계 파괴, 야생동물의 서식지 파괴, 대기 중의 탄소 흡수원 감소, 목재 시장가격 혼란 등 생태·경제적 문제를 일으킨다(Lee et al., 2014). 목재 수종 식별과 원산지 확인은 불법 목재의 유통 방지를 위해 필요하다. 수종 식별 방법으로 현미경을 이용한 목재 해부학적 분석이 주로 사용되었지만, 목재 해부학적 구조에 대한 전문 지식이 필요하며 유사 수종 간 식별에 어려움이 있다(Ohyama et al., 2001; Jiao et al., 2015). 이러한 문제에 대한 대안으로 목재 DNA 분석법이 사용되고 있다(Jiao et al., 2015; Lee et al., 2021).

목재 DNA 분석법은 DNA 다형성을 이용한 종 식별 방법이며(Deguilloux et al., 2002), 표준화된 유전자 영역을 통해 신속하고 정확한 종 식별이 가능하고, 비교적 쉽게 활용할 수 있다는 장점이 있다(Hebert and Gregory, 2005). 이러한 분자 유전학적 방법은 종 식별에서 원산지 확인 및 개별 원목 또는 목재 제품 추적에 이르기까지 다양한 수준에서 목재를 식별하는 데 사용될 수 있다(Lowe and Cross, 2011). 이 분석법을 활용하기 위해서는 고농도의 깨끗한 DNA를 필요로 한다. 그러나 목재는 목질화가 되어 파쇄가 어렵고, DNA 추출과 증폭 효율을 저해시키는 다당류, 단백질, 폴리페놀 등의 화학 물질을 포함하고 있다(Rachmayanti et al., 2009; Abdel-Latif and Osman, 2017). 따라서 목재 조직은 식물 DNA 추출에 주로 사용되는 잎에 비해 추출되는 DNA 양과 질이 좋지 않다(Tang et al., 2011; Fatima et al., 2018).

목재 DNA의 양과 질은 목재 부위에 따라 다르다. 목본식물에서는 형성층에 의해 새로운 목재 조직이 형성됨에 따라 기존 목재 조직은 점차 안으로 위치하게 되며 새롭게 생긴 조직이 상대적으로 바깥에 위치하게 된다. 또한, 목재 조직은 시간이 지남에 따라 세포의 활동력이 둔해지고 결국 사멸하기 때문에(Bamber, 1976), 세포 내 존재하였던 DNA 또한 분해된다(de Souza Borges et al., 2017). 따라서 형성층과 가까운 목재 조직일수록 살아있는 세포의 수가 많고, 세포 사멸 이후라도 DNA 분해 정도가 낮다.

본 연구의 목적은 목재 조직의 생성 후 경과 시간, 즉, 나이가 이 목재 부위로부터 추출한 DNA의 농도 및 순도, 그리고 이 DNA를 이용한 PCR의 성공률에 영향을 주는지 확인하는 것이다. 이를 위해 국내 주요 수종인 소나무(Pinus densiflora) 원목의 나이테 위치에 따른 DNA의 양과 순도 및 PCR 증폭 성공률(%)을 구명하고자 한다. 오래된 목재 조직일수록 온전한 DNA가 감소하고 PCR 방해 물질이 상대적으로 증가하여, 목재 DNA 농도 및 순도, PCR 증폭 성공률이 감소할 것으로 예상하였다.

재료 및 방법

1. 소나무 목재 나이테 위치에 따른 파쇄

실험에 사용된 소나무 목재는 2018년 10월 초에 벌채되었으며, 지름 약 30 cm, 두께 약 4 cm, 수령 48년의 소나무 원판을 사용하였다. 원판 표면의 이물질을 제거하기 위해 멸균된 사포를 이용하여 원판의 겉면을 약 4 mm 정도 갈아주었다. 그 다음 10 %의 차아염소산나트륨과 70 %의 에탄올을 사용하여 겉면을 소독한 다음 1차 증류수로 닦아주었다. 이후 수피에서 중심까지 나이테를 확인하며 5년 간격으로 총 8개의 지점을 선정하여, 10 % 차아염소산나트륨, 70 % 에탄올 용액, 1차 증류수로 소독한 드릴을 사용하여 목재를 파쇄하여 분말로 만들었다(Figure 1). 파쇄된 시료는 1.5 ml tube에 담아 이후 실험에 곧바로 사용하였다.

Figure 1. The crushed points along annual rings on wood disk of Pinus densiflora. The Pinus densiflora wood disk(ø = 30 cm, thickness = 8 cm), the age of which is approximately 48 years, was cut in early October 2018.

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결과 및 고찰

총 24개 샘플(n=24)의 농도(ng/μl)와 순도(A260/A280)의 측정값을 확인한 결과(Table 2), 전체 샘플 농도(ng/μl)의 평균은 2.41(±1.84), 순도(A260/A280)의 평균은 1.16(±0.21)으로, 일반적으로 사용되는 잎의 DNA 농도 및 순도에 비해 상대적으로 낮았다(Fatima et al., 2018). 목재의 경우 DNA 추출 효율을 저해시키는 화학물질을 포함하고 있어 농도(ng/μl)와 순도(A260/A280) 모두 저하되었을 것으로 추정된다(Rachmayanti et al., 2009; Abdel-Latif and Osman, 2017).

소나무 목재의 나이테 생성 시기에 따른 추출 DNA 농도(ng/μl)와 순도(A260/A280)에 대한 회귀분석 결과, DNA 농도는 나이테가 형성층으로부터 멀어질수록 유의하게 감소하였다[β=−0.05, P<0.01; Figure 2(a)]. DNA 순도 또한 형성층으로부터 멀어질수록 유의하게 감소하였다[β=−0.01, P<0.05; Figure 2(b)].

Figure 2. The decrease in (a) DNA concentration(ng/μl) and (b) purity(A260/A280) by annual rings on wood disk of Pinus densiflora.

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PCR 증폭 산물에 대한 전기영동 및 염기서열 분석을 통해 증폭 성공 여부를 확인하였다(Figure 3, Table 3). 확인 결과 trnM-trnV, rpoC1 partial 영역의 경우 총 24개의 샘플에서 모든 조건에서 증폭 성공률이 100 %로, 독립변수에 따른 변화를 볼 수 없었다(Table 2). rbcL partial 영역의 경우 24개 중 16개 시료에서 PCR을 성공하여 전체 증폭 성공률은 66.67 %였다(Table 2). 나이테에 따른 rbcL partial 영역 증폭 성공률은 30년 이하에서 15개 시료 모두 증폭에 성공하였고(100 %), 35년에는 3개 중 1개만(33 %) 증폭됐으며, 40년 이상에서는 6개 시료 모두 증폭에 실패하여(0 %), 오래된 조직에서 증폭 성공률이 낮음을 확인할 수 있었다(Table 2). 이 결과는 rbcL partial 영역의 증폭 산물 길이가 다른 영역(trnM-trnV, rpoC1 partial 영역)에 비해 길기 때문인 것으로 판단된다. 길이가 긴 영역의 경우 시간이 경과함에 따라 변형이 일어날 가능성이 높아 PCR 성공률이 감소하는 것으로 알려져 있다(Deguilloux et al., 2002; Lee et al., 2021). 목재 DNA와 같이 변형이 예상되는 DNA를 대상으로, 다양한 길이의 영역 또는 동일 영역 내 길이를 달리한 nested PCR 등의 연구를 통해 최적 증폭 영역 길이에 대한 구명 또한 필요할 것으로 판단된다.

Figure 3. Example of agarose gel electrophoresis of the PCR products targeting A) trnM-trnV, B) rpoC1 partial region and C) rbcL partial region for DNA extracted from 1~5 annual ring group of Pinus densiflora wood. Lane L: BioFACT 1Kb Plus DNA ladder; A5_1~3: PCR products for DNA from 1~5 annual ring group; N: negative control; P: positive control (Leaf DNA of Pinus densiflora).

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농도(ng/μℓ)에 따른 rbcL partial 영역 PCR 증폭 성공률에 대한 로지스틱 회귀계수는 유의한 증감을 나타내지 않았다[β=1.22, P=0.06; Figure 4(a)]. 그러나, 전체 DNA 농도 의 평균인 2 ng/μl 미만에서 PCR 성공률이 46.2 %(6/13), 2 ng/μl 이상에서는 90.9 %(10/11)의 성공률을 나타내는 것을 확인하였다. 한편, DNA의 순도(A260/A280)는 rbcL partial 영역 PCR 증폭 성공률에 유의한 영향을 주었다[β=5.88, P<0.05; Figure 4(b)]. 실험 결과에 따르면, DNA 순도(A260/A280)는 최소값 0.65에서 최대값 1.52의 범위였으며, 1.04에서 rbcL partial 영역 증폭 성공률과 실패율이 같아졌다. 이는 rbcL partial 영역의 PCR 성공률을 50 % 이상 기대하기 위해서는 DNA 순도(A260/A280)가 1.04 이상이어야 함을 의미하며, DNA 순도 1.27에서 PCR 성공률 80 %를 달성할 수 있을 것으로 예측된다. 나이테에 따른 DNA 순도 변화 회귀식에서 DNA 순도 1.04는 나이테 30.4년 지점이며, 순도 1.27은 6.9년에 해당한다[Figure 2(b)]. 30년이 지나지 않은 목재 조직에서는 모든 시료에서 rbcL partial 영역의 PCR에 성공했지만 이보다 오래된 목재 조직에서는 증폭 성공률이 감소한 것도 이 결과와 관련된 것으로 판단된다. 본 연구 결과에 의하면 DNA 순도에 대한 나이테 회귀식을 기준으로 80 % 이상의 높은 PCR 성공률을 달성하기 위해서는 나이테가 생성된 지 7년 이하의 조직에서 추출된 DNA를 활용하는 것이 적합할 것으로 판단된다.

Figure 4. PCR amplification success rates. (a) DNA concentration(ng/μl), (b) DNA purity(A260/A280).

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추출한 DNA의 농도는 시료 내 살아있는 세포의 양에 영향을 받으며, DNA를 이용하여 목재의 종 동정을 하기 위해서는 높은 농도와 우수한 순도의 DNA 시료가 필요하다. 형성층에 가까운 목질부에는 살아있는 유세포(parenchyma cell)가 풍부하게 존재하지만, 시간이 흐를수록 유세포는 사멸한다(Bamber, 1976; Deguilloux et al., 2002). 유세포 사멸과 함께 세포 내 DNA 또한 분해되기 때문에(Rachmayanti et al., 2009; Finkeldey et al., 2010), 나이테가 오래될수록, 즉 조직 생성 후 시간이 지날수록 추출된 DNA 농도가 감소하였을 것이다. DNA 순도 측정 단위로 사용된 A260/A280은 용액 내 잔류 단백질 대비 DNA 양과 관련하며, 단백질에 의한 DNA 오염을 확인할 수 있는 지표 중 하나로 활용될 수 있다(de Souza Borges et al., 2017; Gallagher, 2017). 목재 조직이 오래될수록 단백질 대비 DNA 양이 감소하여, 이 조직에서 추출된 DNA의 A260/A280 값도 감소하였을 것으로 추정된다. DNA 용액에 잔류하는 단백질들은 DNA 구조를 변형시키거나, polymerase의 작용을 방해하는 등 PCR 억제자(inhibitor)로 역할을 하기 때문이다(Schrader et al., 2012).

본 연구 결과는 오래되지 않은 신선한 목재 조직으로부터 DNA를 추출하여 사용하는 것이 증폭 실험을 위해 효율적이라는 것을 나타낸다. 목재 조직의 신선도와 DNA의 수율 및 증폭 효율과의 관계를 다루는 연구는 지금까지 나이테가 아닌 목재 부위에 따른 신선도를 판단하였다. 예를 들어, 아까시나무(Robinia pseudoacacia), 넓은잎삼나무(Cunninghamia lanceolata), 티크(Tectona grandis) 등의 목재를 대상으로 한 연구에서, 변재의 DNA 추출량과 PCR 성공률이 심재에 비해 높다는 것을 확인하였다(Filippis and Magel, 1998; Rachmayanti et al., 2009; Jiao et al., 2012; Fatima et al., 2018). 그러나, 개체의 생육 상태에 따라 변재와 심재의 면적이 다르며(Morling and Valinger, 1999; Bieker and Rust, 2010), 육안으로 그 위치를 정확히 구분하는 것이 어려울 수도 있다(Saito et al., 2008). 따라서, 명확히 확인 가능한 나이테를 이용하여 조직의 나이를 산정하고 DNA 양 및 순도와 PCR 성공률을 유추하는 것이 효율적일 수 있다. 한편, 본 연구에서는 소나무 한 종만을 대상으로 하였기 때문에, 목재 조직의 나이에 따른 DNA 농도와 순도, 그리고 PCR 성공률의 변화 양상을 명확히 규명하기 위해서 소나무 외의 다른 수종으로 대상을 확대할 필요가 있을 것으로 판단된다.